实时定量PCR的基本原理

1.实时定量PCR

1996年，首先通过美国应用生物系统引入实时定量聚合酶链反应（实时QPCR）。所谓的实时QPCR是指向PCR反应添加荧光基团以连续监测荧光信号。外观的顺序和信号强度的变化可用于实时分析靶基因的初始量。本技术的发明实现了定性对定量PCR的跃升。

2. PCR荧光中使用的化学品

目前，实时QPCR分为两类：荧光染料和荧光探针根据所使用的不同荧光化学物质。

3. PCR荧光中使用的染料

荧光染料也称为DNA结合染料。目前使用的主要染料分子是Sybr Green I. Sybr Green我可以特异性地与DNA双链的少量凹槽结合。免费的Sybr Green I几乎没有荧光信号，但与双链DNA结合。之后，其荧光信号可以增加数百次。随着PCR产物的增加，PCR产物和染料的结合量也增加，荧光信号的强度表示双链DNA分子的数量。

荧光染料的优点是它们易于使用，可以与任何PCR产物组合，并廉价。

通常，SYBR Green I方法是最基本和常用的实时QPCR实验之一。

4. PCR荧光的探针

实时QPCR中最常用的荧光探针是Taqman探针。基本原理是设计和合成可以特别杂交给靶基因的探针。探针的5'末端用荧光团标记，3'末端用猝灭剂组标记。

在正常情况下，两组之间的空间距离非常接近，荧光基因由于淬火而不能荧光。在PCR扩增期间，底漆和探针同时与模板结合，探针的结合位置位于上游和下游引物之间。

当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶使用5'外切核酸酶活性，将荧光分子与探针的5'末端的荧光分子切割成，导致其发荧光。检测到的荧光分子的数量与PCR产物的数量成比例，因此，可以根据PCR反应系统中的荧光强度计算初始DNA模板的数量。

塔克曼探针技术解决了荧光染料和非特异性扩增的组合的问题。反应后，不需要熔化曲线检测，这缩短了测试时间。

塔克曼探针技术的优点是荧光背景，高灵敏度，高杂交稳定性，良好的荧光光谱分辨率和高特异性。

由于Taqman探针的特异性，它可用于等位基因辨别，特别是对于人类基因多态性并基于SNP来区分和量化菌株。